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免疫印迹(WB)

日期:2015/4/27 8:48:44 人气:4309


免疫印迹(WB)方法

1.试剂和溶液

1)转印缓冲液:0.025M Tris base , 0.187 M甘氨酸 , 25%甲醇
2)氨基黑溶液:0.1% 酸性黑10B
3)1×TBST:25mM Tris-HCl ( pH 8.0 ) , 0.2 M NaCl , 0.1%Tween 20
4)封闭液:TBST配制的5%牛奶
5)抗体稀释液:TBST配制的5%牛奶
6)显色系统:ECL显色
2.实验步骤
1 电泳:将裂解液进行SDS-PAGE电泳,80v,30分钟,120v,90分钟;
2 转膜:PVDF膜在甲醇中浸泡约30秒左右,滤纸浸泡在转印缓冲液预湿,半干法转印到PVDF膜上,10v,150分钟;
3 染色:氨基黑染色5分钟,甲醇褪去背景色,观察条带;
4 膜活化:将PVDF膜置于甲醇活化1min,用纯水洗膜2次后再用TBST洗涤3次;
5 封闭:将膜条置于5%牛奶或2% BSA中,室温混摇2h;
6 一抗孵育:将待检抗体用3%牛奶或2% BSA稀释到合适浓度(参照抗体说明书,根据客户预实验结果,稀释度上下浮动一个数量级都为正常),将膜放入对应的已稀释待检样品中,置4℃混摇孵育过夜;
7 洗涤:取出膜放在TBST中洗涤3×5min;
8 二抗孵育:将膜取出放入稀释好的HRP标记的二抗(参照二抗说明书进行稀释)中,室温混摇2h;
9 洗涤:取出膜放在TBST中洗涤3×5min;
10 ECL显色:将膜取出放入混匀的ECL显色液中,孵育3min,将膜取出贴在有荧光角标的胶片上,迅速用保鲜膜包好;
11 曝光:把底片放在暗盒中,根据荧光强度分别对X光胶片作不同时间段的曝光,曝光结束后,将底片取出,1min显影,30s清洗,1min定影,30s清洗,晾干;
12 结果分析:用扫描仪将曝光后的X光胶片扫描,做后续结果分析。



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