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AnnexinV/PI双染凋亡细胞检测

日期:2015/6/4 14:37:29 人气:5304

AnnexinV/PI双染凋亡细胞检测protocol


一、原理

    磷脂酰丝氨酸(PhosphatidylserinePS)正常位于细胞膜的内侧,但在细胞凋亡的早期,PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,暴露在细胞外环境中。Annexin V 是一种分子量为35~36kD Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,能与PS 高亲和力特异性结合。将Annexin V 进行荧光素(FITCPE)或Biotin 标记,以标记了的Annexin V 作为荧光探针,利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。

碘化丙啶(PI)是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,但在凋亡中晚期的细胞和死细胞,PI 能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin V PI 匹配使用,就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。

二、方法

1、调整待检测细胞浓度为106/ml,取200ul, 1000rpm×5min(4℃)

2、预冷的PBS1ml 润洗两次21000rpm×5min(4℃)

3、将细胞重悬于100ul binding buffer,加入2ulAnnexin-V-FITC(20ug/ml),轻轻混匀,避光冰上放置15分钟。

4、转至流式检测管,加入400ulPBS,每个样品临上机前加入1ulPI50ug/ml),2分钟后迅速检测。

5、同时以不加Annexin V-FITC PI 的一管作为阴性对照。

三、注意事项

1、整个操作动作要尽量轻柔,勿用力吹打细胞。

2、操作时注意避光,反应完毕后尽快在一小时内检测

四、结果判定

AnnexinV为横轴,PI为纵轴;

左上象限为机械性损伤细胞;

右上为晚期凋亡细胞或者坏死细胞;

左下为阴性正常细胞;

右下为早期凋亡细胞。

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